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你知道細(xì)胞凍存的原理和實驗步驟嗎?

 更新時間:2023-09-11 點擊量:887

細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常用技術(shù)。那么你知道細(xì)胞凍存的原理和實驗步驟嗎?讓我們一起來看看吧!

原理:

將細(xì)胞放在-196℃液氮中,可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài),減少細(xì)胞代謝,理論上儲存時間幾乎是無限的。最佳的冷凍條件是盡可能地降低細(xì)胞內(nèi)的晶體形成,減少細(xì)胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細(xì)胞造成的低溫?fù)p傷。上述要求可通過下列方法獲得:

1.緩慢冷凍,使細(xì)胞內(nèi)水分離開細(xì)胞,但不可太慢,以避免冰晶形成;

2.用親水的低溫保護(hù)劑排除水分;

3.在盡可能低的溫度下保存細(xì)胞,降低高濃度鹽對冰中蛋白質(zhì)變性的影響;

4.快速復(fù)蘇,減少細(xì)胞內(nèi)晶體形成,以及細(xì)胞內(nèi)殘余的冰溶解時可溶性成分的產(chǎn)生。

實驗步驟:

1.選擇無支原體污染且對數(shù)生長期的細(xì)胞,并且在收獲細(xì)胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液;

2.按常規(guī)方法將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化,然后 1000rpm 離心 5 分鐘,去上清并收集細(xì)胞。然后加入已經(jīng)配置好的凍存液,常用的凍存液是DMSO +wan全細(xì)胞生長培養(yǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液),吸管輕輕吹打,重懸細(xì)胞。計數(shù),調(diào)整至5×106/ml左右;

3.將細(xì)胞懸液分裝于無菌凍存管中,每管加1.5m懸液,旋好凍存管并仔細(xì)檢查,一定要蓋緊,做好標(biāo)記;

4.凍存:在液氮容器中,對大多數(shù)細(xì)胞來說,每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的,通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃放1-2個小時,再放入 -80℃冰箱過夜,再轉(zhuǎn)入液氮罐,注意下降冷凍速度,過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,太慢則促進(jìn)冰晶形成。推薦使用程序降溫盒,操作方便,凍存效果更好。

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