ELISA檢測方法
 

　　一、elisa直接法
 

　　直接ELISA法是將抗原固定在96孔板上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，測定結(jié)果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原通過吸附而不是特異性固定的，樣本中的所有蛋白質(zhì)(靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白)都會固定在96孔板上，導(dǎo)致背景比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要標(biāo)記與其特異性結(jié)合的一抗，實(shí)驗(yàn)顯得不太靈活。另外由于沒有使用二抗，沒有放大作用，降低了測定的靈敏度。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測速度快，因無須使用二抗可避免交互反應(yīng)。
 

　　缺點(diǎn)：試驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記，但不是每種抗體都適合做標(biāo)記，費(fèi)用相對提高。
 

　　二、Elisa間接法
 

　　在直接法的基礎(chǔ)上，Lindström 和Wager 引入二抗建立了間接 ELISA 方法，通過使用一抗能結(jié)合多個二抗，從而放大了檢測靈敏度，同時，不需要標(biāo)記一抗，只需要加入抗一抗種屬的標(biāo)記二抗就可以進(jìn)行檢測，克服了直接法的局限性。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：只要更換不同的固相抗原，就可以用標(biāo)記二抗檢測各種與抗原相結(jié)合的抗體，二抗可以加強(qiáng)信號，不加標(biāo)記一抗體則能保留一抗最多的免疫反應(yīng)性。
 

　　缺點(diǎn)：存在交叉反應(yīng)的可能性，抗原純度不夠會導(dǎo)致非特異結(jié)合，產(chǎn)生假陽性。
 

　　三、Elisa夾心法
 

　　雙抗體夾心法將捕獲抗體固定在96孔板上，加入樣品，通過捕獲抗體結(jié)合目標(biāo)抗原，洗去未結(jié)合的雜質(zhì)后，加入酶標(biāo)檢測抗結(jié)合目標(biāo)抗原的另一表位(如果檢測抗體不帶有標(biāo)記，則需使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA)，形成“sandwich” 的結(jié)構(gòu)，此時的抗原就像被兩個面包片夾著的奶油，通過酶催化發(fā)生顯色反應(yīng)就可以測定抗原的含量。雙抗體夾心法測抗原，對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為捕獲抗體和酶標(biāo)檢測抗體。適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化，進(jìn)行操作時不需稀釋，夾心ELISA尤其適用于復(fù)雜樣品的分析，因?yàn)榭乖唤?jīng)純化仍具能有高靈敏度和特異性。
 

　　缺點(diǎn)：抗原分子上需擁有兩個不同抗原決定簇，對配對抗體要求很高，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體，則需要進(jìn)行配對抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化，因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。
 

　　四、Elisa競爭法
 

　　競爭法是所有ELISA 里最為復(fù)雜的測試方法，通過檢測競爭信號的強(qiáng)度來反應(yīng)樣品中的抗原水平，通常以酶標(biāo)抗原作為競爭抗原，與樣品來源的抗原形成直接競爭，搶奪過量的固定化抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，因此競爭信號越高，說明樣品中的抗原越少。競爭法ELISA既可用于檢測抗體，也可用于檢測抗原。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：可用于檢測不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，特異性好。
 

　　缺點(diǎn)：操作方法更復(fù)雜一些，產(chǎn)品性能取決于抗體的親和力。整體的敏感性和專一性都較差。
 

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